Выделение мононуклеарных клеток: Ficoll 400×g против CPT
1.16×10^6 клеток/мл после Ficoll 400×g и 1.34×10^6 клеток/мл после CPT 1700×g: у шести здоровых взрослых доноров выход свежих PBMC не различался значимо (P=0.398). Жизнеспособность осталась высокой: 97.2% против 93.3% (P=0.057). Для лаборатории при выделении мононуклеарных клеток вопрос один: даёт ли классический градиент Ficoll-Paque тот же выход, что трубки BD Vacutainer CPT.
Цифры из парного сравнения Corkum и коллег (2015). Hard/light spin плазмы здесь не сравниваем: тот сюжет в материале про центрифугирование компонентов крови. Модель центрифуги в работе не названа.
Совпали ли Ficoll 400×g и CPT 1700×g по выходу PBMC?
По среднему выходу при выделении клеток крови ветки совпали. Corkum и коллеги брали кровь у шести здоровых взрослых доноров: около 45 мл на Ficoll в пробирках ACD-A и параллельно около 45 мл в CPT с 0.1 M цитратом натрия. С каждого донора шли обе ветки, поэтому сравнение парное, не межгрупповое.
Сравнивали выход и жизнеспособность свежих PBMC у здоровых доноров. Состав субпопуляций и больные образцы остаются отдельными сюжетами. Режим 500×g на AML к этому стенду не относится.
Как ставили градиент: 400×g и 1700×g
Объём забора совпал, механика градиента нет. Ветку Ficoll начинали с предспина: ACD-A кровь крутили 800×g 30 мин, верхний слой плазмы снимали. Оставшуюся кровь разводили равным объёмом PBS с 0.05 M EDTA. На 25 мл Ficoll-Paque PLUS клали 12.5 мл разведённой крови. Градиент: 400×g 30 мин при комнатной температуре, бакет-ротор, без тормоза. Интерфейс с PBMC снимали пипеткой и отмывали PBS-EDTA: осаждение клеток на смыве 250×g 10 мин.
CPT ставили иначе. Сразу после забора трубки 10 раз переворачивали и крутили 1700×g 30 мин при комнатной температуре в бакет-роторе. С верхнего слоя снимали 3 мл плазмы. Дальше слой PBMC осторожно суспендировали в оставшейся плазме, переносили в конические пробирки 15 мл и отмывали PBS: 300×g 10 мин. Визуально эритроцитов в слое CPT было больше, чем после Ficoll, это совпало с указанием производителя трубок. Осадки CPT ещё 10 мин держали в ACK-буфере при комнатной температуре и снова отмывали PBS, чтобы ветки оставались сопоставимы.
Выход и жизнеспособность: цифры сравнения
Ficoll: SEM 1.49×10^5, диапазон 5.71×10^5-1.67×10^6 клеток/мл. CPT: SEM 1.19×10^5, диапазон 9.43×10^5-1.71×10^6. P=0.398. Интервалы перекрываются, средние рядом. На шести донорах статистика не показывает различия по выходу.
Жизнеспособность: 97.2% после Ficoll и 93.3% после CPT, P=0.057. Corkum пишут, что оба метода дали высокую жизнеспособность, различие не значимо. P близко к 0.05, но порог в работе не перейден. Вывода «CPT хуже по живым клеткам» в тексте нет.
Corkum допускают подставить CPT вместо Ficoll, когда нужно очистить иммунные субпопуляции: без проигрыша в количестве клеток и в количестве и целостности нуклеиновых кислот. Формулировка про свежие PBMC здоровых доноров, не про лейкозную кровь.
Практика: выделение мононуклеарных клеток в лаборатории
Для постановки градиента нужны два разных g при одном времени 30 мин и два смыва по 10 мин. Режимы сведены в таблицу.
| Режим | g | Время | Что получали |
|---|---|---|---|
| Ficoll градиент (S1) | 400×g | 30 мин | слой PBMC на интерфейсе; бакет-ротор, без тормоза, комнатная температура |
| CPT градиент (S1) | 1700×g | 30 мин | слой PBMC; визуально больше загрязнения эритроцитами, чем у Ficoll |
| Смыв интерфейса Ficoll (S1) | 250×g | 10 мин | отмывка PBMC PBS-EDTA |
| Смыв слоя CPT (S1) | 300×g | 10 мин | отмывка PBMC PBS |
| Ficoll на AML (S2), не протокол здоровых доноров | 500×g | 20 мин | ограничение: смещение состава лейкоцитов, не цифра выхода S1 |
По паспорту низкоскоростной напольной центрифуги DD5 максимум 4730xg, вместимость 4×800 мл: режимы 400×g и 1700×g входят в этот диапазон. В работе Corkum пробы около 45 мл. Сбор клеток из бутылей 400-800 мл - другая задача: выделение и культивирование клеток большого объёма, не забор S1.
Речь о целых мононуклеарах, а не о дифференциальном центрифугировании ядер и митохондрий. Контур культур: условия культивирования клеток в CO2-инкубаторе.
Как выбрать низкоскоростную центрифугу большого объёма для ваших задач?
Градиент 400×g и CPT 1700×g требуют разных g при одном таймере. Прибор берут под протокол лаборатории, а не копируют стенд Corkum один в один.
- 2. Вместимость: до 4×800 мл, по карточке также 4×450 мл пакетов для крови. В S1 пробы около 45 мл; бутыли 400-800 мл - harvest, не забор Corkum.
- Таймер: градиент 20-30 мин и смывы 10 мин. Таймер модели 1-9ч59мин.
- Перевод об/мин в RCF: на карточке перевод есть, готовое значение 4730xg. Радиус ротора не указан, RCF по формуле не пересчитывать.
- Ускорение и торможение: 10 режимов. В S1 ветка Ficoll шла без тормоза; это условие стенда, его сверяют с протоколом лаборатории.
- Температура: оба протокола S1 при комнатной температуре. Охлаждения у модели нет, температурный диапазон на карточке не задан.
- Исполнение: напольное, 600×510×800 мм, 108 кг. Точность скорости ±20 об/мин; питание 220 В/110 В, 50 Гц/60 Гц.
Если вам необходимо подобрать центрифугу под протокол выделения мононуклеаров
Для выделения мононуклеаров на градиенте плотности рассмотрите Низкоскоростная напольная центрифуга DD5 как отправную точку.
Рядом в каталоге смотрите низкоскоростные центрифуги и оборудование для центрифугирования. Если нужна другая конфигурация, напишите: Александра, технический специалист по подбору лабораторного оборудования, поможет подобрать модель под ваш протокол.
- Тел.: 8 (499) 490-02-72
- Email: blog@assa-group.ru
Итог
У шести здоровых взрослых доноров выход свежих PBMC при Ficoll 400×g и CPT 1700×g не различался значимо: 1.16×10^6 против 1.34×10^6 клеток/мл (P=0.398); жизнеспособность 97.2% против 93.3% (P=0.057). n=6, не пациенты; ACK-лизис и доп. смывы могли снизить выход относительно других CPT-протоколов. На AML компаратор - гемолиз, не CPT: градиент истощает гранулоциты, а выделение лимфоцитов и бластов даёт завышенную долю.
Источники:
- Corkum et al. (2015). Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT) and standard density gradient. BMC Immunology. https://doi.org/10.1186/s12865-015-0113-0 · PMC4549105
- E Silva et al. (2026). Ficoll-based isolation biases the profiling of immune cells and leukemic blasts in AML samples. Frontiers in Immunology. https://doi.org/10.3389/fimmu.2026.1920697 · PMC13550220
