Высокоскоростная центрифуга KeCheng 4-30R в пробоподготовке для протеомики
Подготовка белковых проб для масс-спектрометрического (MS) анализа в клинической протеомике требует полного удаления солей, детергентов и хаотропных агентов без потери целевых молекул. Традиционный метод фильтр-ассистируемой подготовки проб (FASP) демонстрирует высокую воспроизводимость на одиночных спин-колонках при ультрацентрифугировании. Однако при попытке масштабировать процесс до 96-луночных планшетов исследователи сталкиваются с падением скорости фильтрации из-за конструктивных ограничений планшетных роторов.
Использование специализированного лабораторного оборудования, такого как настольная высокоскоростная центрифуга KeCheng 4-30R, позволяет оптимизировать индивидуальную пробоподготовку на ультрафильтрационных мембранах, поддерживая необходимое ускорение для быстрой седиментации и очистки белковых фракций.
Почему падение центробежной силы увеличивает время пробоподготовки в разы
Основная проблема масштабирования классического метода FASP на многолуночные планшеты заключается в физическом ограничении прочности пластика планшетов и конструкции бакет-роторов. В то время как индивидуальная микроцентрифужная колонка в фиксированном угловом роторе легко выдерживает перегрузки до 14 000 × g и более, стандартный 96-луночный ультрафильтрационный планшет рассчитан на максимальное ускорение всего до 2 200 × g.
Для решения этой проблемы в высокопроизводительном анализе применяется альтернативный подход — метод MStern Blotting, использующий крупнопористые гидрофобные мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) в сочетании с вакуумной фильтрацией или центрифугированием на умеренных скоростях. Однако для точечной работы с небольшими сериями образцов, где важна максимальная концентрация белка, незаменимым инструментом остается индивидуальная настольная высокоскоростная центрифуга KeCheng 4-30R, обеспечивающая быстрое осаждение на плотных мембранах.
Сравнение эффективности FASP и MStern Blotting при подготовке протеомных проб
Выбор методики пробоподготовки напрямую влияет на количество идентифицированных белков и пептидов в масс-спектрометре. В таблице ниже представлены сравнительные параметры классического метода FASP на ультрафильтрационных мембранах и высокопроизвого метода MStern Blotting на PVDF-мембранах.
| Параметр сравнения | Классический метод FASP (микроколонки) | Высокопроизводительный MStern Blotting |
|---|---|---|
| Тип используемой мембраны | Гидрофильная регенерированная целлюлоза (MWCO 10–30 кДа) | Крупнопористый гидрофобный PVDF (размер пор ~0.45 мкм) |
| Рекомендуемое ускорение | 14 000 × g (требуется высокоскоростная центрифуга) | Вакуумный коллектор или низкоскоростное центрифугирование |
| Время прохождения жидкой фазы | 10–15 минут на один этап при максимальных оборотах | < 1 минуты на один этап под вакуумом |
| Необходимость обессоливания | Обязательная стадия (колонки C18) перед вводом в LC-MS | Не требуется (пептиды элюируются чистым растворителем) |
| Общее время обработки 96 проб | До 2 рабочих дней (при использовании планшетов на 2 200 × g) | 1 рабочий день (полный цикл подготовки) |
При работе по протоколу FASP критически важно использовать качественные лабораторные центрифуги, способные стабильно поддерживать высокие обороты без перегрева камеры, так как тепловое воздействие может вызвать преждевременную денатурацию и агрегацию белков на фильтре.
Как высокоскоростная центрифуга KeCheng 4-30R решает задачи препаративной биологии
Для рутинных анализов в малых объемах (до 1.5–2.0 мл) оптимально подходит высокоскоростная центрифуга KeCheng 4-30R. Благодаря настольному исполнению она компактно размещается в лаборатории и обеспечивает быстрое разделение фаз.
Каковы ключевые технические преимущества центрифуги KeCheng 4-30R?
Высокоскоростная центрифуга KeCheng 4-30R — это настольный прибор, предназначенный для разделения микрообъемов жидкостей. С угловым ротором на 12 микропробирок объемом 1.5/2.0 мл прибор разгоняется до 25 000 об/мин (44 021×g), а на роторе для 4 пробирок — до 30 000 об/мин (62 400×g), что сокращает общее время проведения серийных анализов.
Благодаря высокой стабильности поддержания скорости вращения (±10 об/мин) и автоматическому распознаванию ротора, высокоскоростная центрифуга KeCheng 4-30R гарантирует воспроизводимость результатов при осаждении нуклеиновых кислот, очистке белков и подготовке образцов для ПЦР/ИФА. Для работы с большими объемами или другими типами пробирок в лабораториях также часто применяются универсальные настольные центрифуги, позволяющие гибко менять роторы под текущие задачи.
Физико-химические основы адсорбции белков на PVDF-мембранах
В отличие от ультрафильтрации, основанной на механическом удержании молекул по размеру пор, метод MStern Blotting использует физико-химические свойства поливинилиденфторида. PVDF — это высокогидрофобный полимер. При пропускании денатурированного белкового лизата через такую мембрану происходит эффективная адсорбция белков за счет гидрофобных взаимодействий.
Процесс протекает в три ключевых этапа:
- Активация мембраны: PVDF смачивают этанолом для перевода гидрофобных пор в смачиваемое состояние, после чего промывают буфером.
- Адсорбция белка: Белки, денатурированные мочевиной, связываются с поверхностью мембраны. Крупный размер пор (0.45 мкм) позволяет растворителям и солям мгновенно проходить сквозь фильтр под действием минимального разрежения или при центрифугировании на низких скоростях.
- Ферментативный гидролиз "на мембране" (On-membrane digestion): Трипсин добавляется непосредственно на влажную мембрану. Полученные пептиды теряют гидрофобные свойства, присущие цельной белковой молекуле, и легко вымываются слабым растворителем (например, 40% ацетонитрилом) без удержания на PVDF.
Для точного дозирования реагентов на этапе ферментативного гидролиза и промывки рекомендуется использовать автоматические дозаторы лабораторные, минимизирующие погрешность при работе с микрообъемами.
Практический кейс: валидация MStern Blotting на клинических образцах спинномозговой жидкости
В исследовании группы ученых метод MStern Blotting был протестирован на сложных биологических жидкостях с низким содержанием белка — моче и спинномозговой жидкости (ликворе).
Результаты: Масс-спектрометрический анализ LC-MS/MS показал высокую воспроизводимость метода. В образцах ликвора было надежно идентифицировано большое количество уникальных белков, что полностью соответствует результатам, получаемым при стандартном, но значительно более длительном и трудоемком методе FASP с последующим обессоливанием на C18-колонках. Отсутствие стадии обессоливания позволило избежать потери гидрофильных пептидов, что расширило динамический диапазон детектирования масс-спектрометра.
Нужна высокоскоростная центрифуга для протеомной пробоподготовки?
Для работы с малыми объемами образцов, высокими центробежными нагрузками и спин-колонками в протеомном анализе подойдет Высокоскоростная центрифуга KeCheng 4-30R купить с доставкой по РФ | АССА ЛАБОРАТОРНЫЕ СИСТЕМЫ из нашего каталога — рассмотрите ее как отправную точку.
Если нужна другая конфигурация — напишите нам, наш ведущий специалист Александра поможет подобрать подходящую модель под конкретизацию задачи.
- Тел.: 8 (499) 490-02-72
- Email: blog@assa-group.ru
Итог
Переход от классического метода FASP к мембранным технологиям типа MStern Blotting позволяет обойти ограничения по скорости фильтрации в многолуночных планшетах. При этом для индивидуальной высокоточной подготовки образцов и работы со спин-колонками на максимальных скоростях незаменимым инструментом остается надежная настольная центрифуга с высокими показателями центробежного ускорения.
Источники:
- Manza L.L., Stamer S.L., Ham A.J., Codreanu S.G., Liebler D.C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics, 2005, Vol. 5, pp. 1742-1745. DOI: 10.1002/pmic.200401063
- Wiśniewski J.R., Zougman A., Nagaraj N., Mann M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods, 2009, Vol. 6, pp. 359-362. DOI: 10.1038/nmeth.1322
- Switzar L., van Angeren J., Pinkse M., Kool J., Niessen W.M. A high-throughput sample preparation method for cellular proteomics using 96-well filter plates. Proteomics, 2013, Vol. 13, pp. 2980-2983. DOI: 10.1002/pmic.201300063
Подписка на материалы блога
Оставьте email, чтобы получать новые статьи, новости и обновления товарного портфеля АССА.
