Микроскопия живых клеток: фазовый контраст, инвертированная схема и условия съёмки
Где фазовый контраст перестаёт работать в планшете
В 96-луночных планшетах обычный фазовый контраст покрывает около 2,3% площади лунки. У края клетки остаются, но в зоне сильного изгиба мениска метод перестаёт работать: фон светлеет, ореол пропадает, картина уходит в режим светлого поля. Для микроскопии живых клеток без фиксации и окраски это типичный предел штатного PC в MTP, а не «плохая культура».
Если ежедневная задача - смотреть морфологию в чашке или MTP без переноса на стекло, для лаборатории удобна модульная платформа вроде WideScopiX IRX60 с методами PH и FLUO и держателями для чашек и планшетов.
Микроскопия живых клеток: зачем инвертированный оптический микроскоп
Инвертированный оптический микроскоп ставит объектив снизу, культуральный сосуд - сверху. Чашку Петри или многолуночный планшет с жидкостью кладут на столик; оптика смотрит через дно, не через слой среды и крышку. В работе по компенсации мениска элементы фазового контраста встраивали в ход лучей инвертированной платформы Nikon Ti2 Eclipse: жидкие сосуды с клеточными культурами исследовали именно на таком штативе.
Авторы той же работы прямо пишут: подход применим не только к MTP, но ко всем заполненным жидкостью сосудам, которые помещаются на инвертированные микроскопы. Адаптер фазового контраста в их схеме ставят на обычный инвертированный микроскоп, сохраняя стандартные функции платформы. Для прикреплённых и суспензионных культур в чашках и планшетах инвертированная схема - обычный выбор. Прямой (upright) штатив чаще берут для срезов и препаратов на стёклах, а не для рутинного наблюдения живой культуры в объёме среды. Модель исследовательской установки в статье (Nikon Ti2) задаёт класс оптики, а не перечень коммерческих брендов для закупки.
Какой лучше микроскоп прямой или инвертированный? Для клеток в чашках и планшетах - инвертированный: сосуд стоит устойчиво, объектив работает снизу через дно. Для гистологических срезов на ротационном микротоме и фиксированных препаратов на предметных стёклах чаще удобен прямой. Вопрос не «какой бренд лучше», а какая оптическая схема совпадает с посудой и задачей.
Мениск среды и срыв фазового контраста у края лунки
Фазовый контраст делает видимыми прозрачные неокрашенные клетки. В микротитрационных планшетах поверхностное натяжение среды образует жидкую линзу - мениск. У более изогнутых краёв лунки условия фазового контраста нарушаются, и наблюдение клеток в PC становится невозможным.
Кривизна поверхности отклоняет входящий луч и мешает совмещению condenser annulus с phase ring в плоскости объектива. Особенно у сильно изогнутых краёв этой «линзы» микроскоп фазовый контраст теряет: клетки в этих зонах не удаётся изобразить в режиме PC. В центре лунки, где кривизна меньше, совмещение колец ещё возможно - отсюда узкая полезная площадь у ordinary PC в мелких лунках.
При сканировании 96-well нельзя судить о плотности культуры только по краю. Край часто «пустой» визуально не потому, что клеток нет, а потому что фазовый контраст там сорван геометрией мениска. Яркость фона и отсутствие ореола - сигнал проверить центр лунки и не смешивать картину светлого поля с полноценным PC.
Эксперимент: ordinary PC против adaptive PC в MTP
Задача исследования: сделать видимыми прозрачные неокрашенные клетки в лунках культуральных микропланшетов методом фазового контраста, несмотря на мениск среды. Установка - инвертированный микроскоп Nikon Ti2 Eclipse; посуда - стандартные MTP 6/12/24/96-well с клеточными культурами; объективы 4×/10× phase contrast. Сравнивали ordinary PC и adaptive PC (LCD condenser annulus + liquid prism).
Метрика - доля площади лунки, где выполняются условия фазового контраста (тёмный фон, ореол вокруг клеток; совпадение condenser annulus и phase ring):
Доля полезной площади = A_PC / A_well
Коэффициент прироста:
R = (A_PC / A_well)_adaptive / (A_PC / A_well)_ordinary
| Формат MTP | Обычный PC, % площади лунки | Adaptive PC, % площади лунки | Примечание |
|---|---|---|---|
| 96-well | ~2,3 | ~28 | прирост >12× (R≈12,15); 0,84 → 10,2 mm² из 36,3 mm² |
| 6-well | ~25 | ~46 | почти удвоение |
В 96-well ordinary PC оставляет полезную площадь около 2,3% общей площади лунки; adaptive PC поднимает её примерно до 28% и делает фазовый контраст практически пригодным для неинвазивного сканирования культур в этой посуде. Для рутины полезнее запомнить узкий исходный уровень ordinary PC в мелких лунках и проверять, где именно по площади вы реально видите PC, а где уже светлое поле.
Флуоресцентная съёмка и контроль среды
Когда нужны маркеры РНК или белка в живых клетках, одного фазового контраста мало. Протокол флуоресцентной визуализации живых клеток (семейство Spinach-aptamers) выполняли на флуоресцентном инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti-E в моторизованной термокамере; авторы допускают эквивалентные инвертированные флуоресцентные системы с сопоставимой чувствительностью и контролем среды.
Перед съёмкой культуральную среду меняют на прогретую imaging medium (держать при 37 °C). Камеру микроскопа предварительно уравновешивают до 37 °C и 5% CO₂ не менее 30 мин - те же ориентиры, что и для CO₂-инкубатора клеточных культур, но здесь речь о камере съёмки, а не о длительном культивировании. Затем снимают поля светлого поля и флуоресценции, обычно ближе к центру лунки, где меньше оптических артефактов посуды. Смежная тема стабильности камеры - стерилизация сухим жаром в CO₂-инкубаторе: там угол деконтаминации, не оптика.
Фазовый контраст в пластиковых MTP и флуоресценция на стеклянном дне - разные режимы посуды. Обзор культуры без меток в планшете не отменяет требование стеклянного дна, если цель - флуоресцентные каналы с высокой числовой апертурой. Среду и газовый режим держат стабильными до старта съёмки, иначе дрейф температуры и pH маскирует биологический эффект. Поле светлого поля рядом с флуоресценцией помогает ориентироваться по морфологии, но условия камеры (37 °C, 5% CO₂, ≥30 мин прогрева) относятся именно к интерпретируемой съёмке живых клеток в описанном протоколе, а не к паспорту произвольного инвертированного штатива.
Ограничения и подбор инвертированного микроскопа для культур
Числа ordinary vs adaptive PC и протокол 37 °C / 5% CO₂ относятся к конкретным публикациям (Nikon Ti2 / Ti-E). Мениск актуален для любой PC-платформы с жидкостью в лунке: край нельзя читать как «отсутствие клеток». Adaptive-прирост - свойство описанного адаптивного метода на тех же MTP; его нельзя переносить на любой штатный inverted без адаптивной оптики. Результаты PMC10082838 и PMC13293987 к коммерческим моделям не привязаны.
Для чашек и планшетов нужна инвертированная схема с фазовым контрастом; для маркеров - флуоресцентный модуль и подходящая посуда. WideScopiX IRX60 (серия Soptop IRX) - модульная платформа с методами PH и FLUO и держателями для чашек и планшетов; на карточке опции BF, DF, Pol, DIC, Hoffman без фиксации одной «базовой» комплектации. Live-cell imaging и CO₂-камера на карточке не заявлены.
Напишите нам: Александра, технический специалист по подбору лабораторного оборудования, поможет собрать конфигурацию под вашу посуду и методы.
Тел.: 8 (499) 490-02-72
Email: blog@assa-group.ru
- Adaptive phase contrast microscopy to compensate for the meniscus effect. Sci Rep. DOI: 10.1038/s41598-023-32917-6; PMC: PMC10082838.
- Visualizing Diverse RNA Functions in Living Cells With Spinach™ Family of Fluorogenic Aptamers. Bio Protoc. DOI: 10.21769/bioprotoc.5504; PMC: PMC13293987.
