ВЭЖХ для количественного определения витаминов: валидация метода на примере витамина D3
Изократический NP-HPLC для витамина D3 в таблетках Osso-D прошёл валидацию по USP/BP и ICH с линейностью r = 0,999, RSD повторяемости 0,1741% и пределами LOD 0,0539 µg/mL / LOQ 0,1633 µg/mL. На трёх производственных партиях assay составил 100,78% / 102,81% / 100,81%.
Разберём, как авторы собрали метод определения витаминов ВЭЖХ для холекальциферола в таблетках: колонка, УФ-детекция, калибровка, критерии ICH/USP и сводная таблица результатов.
Что дала валидация NP-HPLC для витамина D3 в таблетках
Авторы построили изократическую схему на силикагеле с УФ-детекцией и проверили её по accuracy, precision, specificity, robustness и пределам количественного определения - для рутинного вэжх количественного определения витамина D3 в твердой лекарственной форме.
Линейность в диапазоне 80-120% тестовой концентрации признана приемлемой (r = 0,999). Время удерживания около 4,8 мин. Шесть повторных определений дали RSD 0,1741% при критерии не более 2% для лекарственного препарата. LOD и LOQ рассчитали из калибровочной регрессии. На коммерческих партиях Osso-D содержание оказалось близко к заявленному уровню. Цифры собраны в таблице ниже; перенос метода на другие условия - в отдельном разделе.
Выбор колонки, детектора и режима для количественного ВЭЖХ витаминов
Метод определения витаминов вэжх опирается на согласованную пару «колонка + подвижная фаза» под химию аналита, длину волны детекции в характерной зоне поглощения и калибровку «площадь пика - концентрация» в рабочем диапазоне. Для жирорастворимого D3 в работе S5 выбрали нормально-фазную схему на силикагеле и изократический режим: без градиентной сложности там, где она не нужна, проще держать рутинный QC.
Вэжх методики определения витаминов в пище и кормах чаще упираются не в насос, а в пробоподготовку. Обзор по жидкостной хроматографии нутриентов в кормах и пищевых продуктах подчёркивает: до HPLC типичны омыление, твердо-жидкостная или жидкость-жидкостная экстракция и концентрирование; от подготовки пробы зависит точность. Объект S5 - фармтаблетки с собственной подготовкой (в среде n-hexane), поэтому контекст S4 для food/feed здесь методический фон, а не копия протокола таблеток.
Колонка и подвижная фаза под D3
Рабочий набор S5: колонка L3 silica, размер частиц 5 µm, 4,6 mm × 250 mm; подвижная фаза n-hexane/ethyl acetate 85:15 (v/v); поток 2,0 mL/min. Нормально-фазная пара растворителей согласована с полярностью стационарной фазы и с задачей удержать холекальциферол в удобном окне по времени.
Детекция и калибровка
Детектирование вели при 292 nm - в зоне, характерной для витамина D3 в этой методике. Количественную шкалу строили по площади пика против концентрации в диапазоне 80-120% тестовой концентрации. Без калибровки вэжх количественное определение сводится к качественному «есть пик / нет пика»; валидация линейности показывает, насколько отклик пропорционален концентрации в заявленном окне.
Условия эксперимента: изократическая NP-HPLC и критерии ICH/USP
Задача работы S5: разработать и валидировать простой изократический NP-HPLC метод количественного определения витамина D3 (холекальциферол) в таблетированной лекарственной форме для рутинного контроля качества. Объект - коммерческие таблетки Osso-D (Amson Vaccines and Pharma).
Хроматографические условия: L3 silica 5 µm, 4,6 × 250 mm; n-hexane/ethyl acetate 85:15 (v/v); 2,0 mL/min; 292 nm. Валидацию вели по accuracy, precision, specificity, robustness и пределам количественного определения согласно монографиям USP/BP и руководствам ICH. Прибор в статье - Shimadzu LC 20AT с УФ-детектором SPD-20A.
Измерение включало калибровку площадь vs концентрация (80-120%), оценку пригодности системы и повторяемости по шести репликам при 100% тестовой концентрации, проверку робастности при намеренных сдвигах потока и состава подвижной фазы, расчёт LOD/LOQ из регрессии и assay трёх производственных партий.
Стандарты вэжх здесь задают каркас критериев приемлемости: что считать линейностью, какой RSD допустим для лекарственного препарата, как формально вводят LOD и LOQ. Для лаборатории это перечень «что проверить», а не готовый номер ГОСТа на все витамины.
Линейность, прецизионность, пределы и робастность
Калибровка и линейность
В диапазоне 80-120% тестовой концентрации коэффициент корреляции составил 0,999 (регрессионный анализ). Авторы считают линейность и диапазон приемлемыми; в тексте работы ориентир для линейности - не ниже 0,997. Время удерживания витамина D - около 4,8 мин. Recovery на уровне 100% в сравнении с литературой указан как 99,42%.
Пределы обнаружения и количественного определения
LOD и LOQ рассчитаны из калибровочной регрессии по уравнениям авторов:
LOD = 3.3 · σ / s
LOQ = 10 · σ / s
где σ - стандартное отклонение (y-intercept / residual), s - наклон калибровочной прямой. Численные результаты: LOD = 0,0539 µg/mL, LOQ = 0,1633 µg/mL.
| Параметр валидации | Результат | Критерий / примечание | Источник |
|---|---|---|---|
| Линейность (r) | 0,999 | Диапазон 80-120% тестовой концентрации | C3 |
| Repeatability (RSD) | 0,1741% | ≤2% для лекарственного препарата | C4 |
| LOD | 0,0539 µg/mL | Из калибровочной регрессии | C5 |
| LOQ | 0,1633 µg/mL | Из калибровочной регрессии | C5 |
| Робастность: поток | RSD 0,81% | Приемлемо по авторам | C6 |
| Робастность: состав МФ | RSD 0,72% | Приемлемо по авторам | C6 |
| Assay партий #97/#98/#99 | 100,78 / 102,81 / 100,81% | Osso-D tablets | C7 |
Границы применимости метода и подготовка пробы
Цифры валидации S5 (r, RSD, LOD/LOQ, assay) относятся к NP-HPLC для витамина D3 в таблетках Osso-D на Shimadzu LC 20AT / UV SPD-20A при описанных условиях (L3 silica, n-hexane/ethyl acetate 85:15, 2,0 mL/min, 292 nm). Это не универсальный протокол для всех витаминов и матриц, не паспорт другой HPLC-системы и не характеристика жидкостного хроматографа «Скороход» SplitLoop. Перенос на другую колонку, прибор или пробоподготовку требует собственной валидации.
Вывод и подбор ВЭЖХ-системы под количественный контроль витаминов
Количественный ВЭЖХ витаминов держится на согласованных колонке и подвижной фазе, УФ-детекции в характерной зоне, калибровке площадь/концентрация и полном наборе параметров валидации ICH/USP (accuracy, precision, specificity, robustness, LOD/LOQ). Пример S5 показывает: для QC D3 в таблетках хватает аккуратной изократической NP-схемы с формальными пределами и проверкой на партиях.
Для таких задач в каталоге АССА доступен жидкостный хроматограф «Скороход» SplitLoop (производитель Sevko&Co, поставка АССА): изократическое элюирование, диапазон потока 0,001-10 мл/мин, УФ-детекция в диапазоне 265-900 nm (фиксированные длины волн), точность формирования градиента ±0,5% по карточке.
Если нужна ВЭЖХ-система под количественное определение витаминов или уточнение конфигурации под вашу методику, начните с карточки жидкостного хроматографа «Скороход» SplitLoop.
Александра, технический специалист по подбору лабораторного оборудования: тел. 8 (499) 490-02-72, email blog@assa-group.ru.
Источники:
- Development and Validation of Novel HPLC Methods for Quantitative Determination of Vitamin D3 in Tablet Dosage Form. Pharmaceuticals. 2024. DOI: 10.3390/ph17040505
- Liquid Chromatography Analysis of Common Nutritional Components, in Feed and Food. Foods. 2019. DOI: 10.3390/foods8010001
Теги: вэжх определение витаминов, вэжх витаминов, метод определения витаминов вэжх, вэжх количественное определение, стандарты вэжх