Как выбрать амплификатор в режиме реального времени
48 лунок по 0,2 мл или 192 лунки по 0,045 мл. От этого зависит, войдут ли сравниваемые образцы в одну постановку. Для амплификатора в режиме реального времени это первый пункт ТЗ, если лаборатория сравнивает уровни экспрессии.
В MIQE рекомендуют класть в один прогон как можно больше образцов: так меньше технической вариации между прогонами S1. Насколько падает разброс, не измерено. Ниже карточка Амплификатор Real-time DT-Lite под малый и средний поток.
Формат термоблока и один прогон
ДНК амплификатор в реальном времени под малый и средний поток выбирают по тому, сколько образцов встанет рядом.
Авторы MIQE различают две раскладки S1. В первой в прогон кладут как можно больше образцов. Вторая раскладка разбирает несколько генов в том же прогоне. Для сравнения экспрессии между образцами они рекомендуют первую: меньше технической межпрогонной вариации. Это совет по планшету: процент выигрыша не измерен.
Если образцы в один прогон не входят, в обоих прогонах ставят одни и те же межпрогонные калибраторы, IRC S1. Поправку считают по разнице Cq или нормализованного относительного количества между этими калибраторами. Формулы поправки в абзаце нет, допустимый разброс Cq тоже не задан.
На карточке Амплификатор Real-time DT-Lite под такую раскладку три блока:
- S1: моноблок, 48 лунок по 0,2 мл.
- S2: двухсекционный блок, 2x24 лунки по 0,2 мл.
- L1: моноблок, 192 лунки по 0,045 мл.
L1 остаётся в том же компактном контуре: лунка 0,045 мл и больше позиций, не отдельная линия под большой поток. Амплификатор для проведения ПЦР в формате S1 или S2 работает с пробирками 0,2 мл. У S2 тоже 48 позиций, только блок из двух секций по 24.
Каналы детекции и мультиплекс
Для нескольких мишеней в одной пробирке ПЦР амплификатор в реальном времени выбирают ещё и по каналам. На карточке Амплификатор Real-time DT-Lite их 4 или 5, на выбор. Спектр четырёх каналов: 470-675 нм. У пяти каналов спектр 470-750 нм. Имена красителей в карточке не приведены.
Амплификатор ПЦР в режиме реального времени под несколько мишеней опирается на 4 или 5 каналов и спектр. Проверку количественности проводят отдельно от числа каналов.
Возбуждение на карточке идёт от LED, срок эффективной работы до 100 000 ч. Детектор - CCD-массив. Чувствительности и предела обнаружения прибора там нет. В MIQE предел обнаружения относится к калибровочной кривой анализа, не к паспорту установки S1.
Контроли, которые задаёт протокол
NTC раскапывают и загружают последними S1.
Эффективность каждого анализа сообщают по калибровочной кривой S1. В публикацию входят наклон, пересечение с осью y, линейный динамический диапазон и предел обнаружения. Кривые целиком отдают на рецензию. Числового критерия годной эффективности в этих предложениях нет.
Химию из того же перечня на модель не переносят S1. Для химии SYBR Green димеры праймеров могут дать положительный Cq в NTC, и по этому сигналу задают условия отбраковки данных. Контроль без амплификации для проб описан отдельно: он помогает отслеживать деградацию пробы. Между этими пунктами перечня идут положительные контроли: их удобнее всего делать как кривые разведения целевого гена. Они обязательны, если измеряют малое число копий и когда нужен уверенный отрицательный результат, например при поиске патогенов.
IRC не нужны, если все образцы уже в одном прогоне. Проверку ингибиторов в образце NTC не заменяет. Паспорт установки эти абзацы не задают.
Карточка Real-time DT-Lite в техническом задании
ПЦР амплификатор под компактный поток сверяют с карточкой Амплификатор Real-time DT-Lite. В таблице пункт ТЗ, зачем он нужен и что записано на приборе.
| Что заложить в ТЗ | Зачем | Что на карточке |
|---|---|---|
| Формат термоблока | Максимум образцов в одном прогоне снижает техническую межпрогонную вариацию при сравнении экспрессии. Иначе нужны одинаковые IRC. | S1: моноблок, 48 лунок по 0,2 мл. S2: двухсекционный блок, 2x24 лунки по 0,2 мл. L1: моноблок, 192 лунки по 0,045 мл. |
| Число каналов и спектр | Нужно показать, что мультиплекс не портит количественность нескольких мишеней в одной пробирке. Порога ошибки нет. | 4 или 5 каналов на выбор. 4 канала: 470-675 нм. 5 каналов: 470-750 нм. Возбуждение: LED, до 100 000 ч. Детектор: CCD-массив. |
| Температура блока и крышки | Режим задают на приборе. | Блок от 0 до 100°С. Крышка 105°С. Дискретность 0,1°С. Точность ±0,2°С. Автоподстройка крышки по высоте пробирок. Элемент: Пельтье. |
| Скорость нагрева и охлаждения | Скорость зависит от серии блока на этой карточке. | Серия S: нагрев 5,0°С/с, охлаждение 2,5°С/с. L1: нагрев 3,5°С/с, охлаждение 1,5°С/с. |
| Контроль без матрицы (NTC) | Контроль контаминации ПЦР в каждом эксперименте, не параметр оптики. | Отдельной характеристики NTC на карточке нет. В ТЗ остаётся пункт протокола. |
| Габарит и масса | Настольная установка под малый и средний поток. | 21 x 48 x 31 см. Масса 17 кг. Производитель: ДНК-Технология. |
| ПО и открытая система наборов | Оценку и трактовку ведут в программе, не по числу каналов. | DT-Master: количественная оценка ДНК/кДНК, кривые плавления, уровень экспрессии, биоценозы, SNP. Дополнительные стандарты, протоколы с автоматической трактовкой, сопряжение с ЛИС, работа без компьютера, открытая система наборов и реагентов. |
В карточке указано наличие регистрационного удостоверения, номер не приведён. Отметка относится к допуску для клинически значимых результатов ПЦР-анализов.
Как выбрать амплификатор в режиме реального времени для ваших задач?
Ниже семь пунктов ТЗ: правило выбора рядом, полные строки паспорта в таблице выше.
- 2. Число каналов: 4 канала на 470-675 нм или 5 на 470-750 нм. Красители не названы. Мультиплекс проверяют отдельно: количественность нескольких мишеней в одной пробирке не должна пострадать.
- Межпрогонные калибраторы: IRC нужны, только если образцы не вошли в один прогон. Поправка по разнице Cq или нормализованного относительного количества. Формулы в рекомендации нет.
- Контроль без матрицы: NTC ставят в каждом эксперименте против контаминации ПЦР. Димеры праймеров и контроль деградации пробы относятся к химии анализа, не к модели.
- Калибровочная кривая: В публикацию входят наклон, пересечение с осью y, линейный динамический диапазон и предел обнаружения. Порога годной эффективности нет. Чувствительности прибора в карточке нет.
- Габарит и температура: 21 x 48 x 31 см, 17 кг, блок 0-100°С, крышка 105°С, шаг 0,1°С, точность ±0,2°С, автоподстройка крышки. Серия S: 5,0°С/с нагрев и 2,5°С/с охлаждение. L1: 3,5°С/с нагрев и 1,5°С/с охлаждение.
- ПО DT-Master: В программе количественная оценка, кривые плавления, экспрессия, биоценозы, SNP, ЛИС, работа без компьютера и открытая система наборов. В карточке указано наличие регистрационного удостоверения, номер не приведён.
Если вам необходимо подобрать амплификатор под поток лаборатории
Когда лаборатории нужно купить ПЦР амплификатор под свой поток, рассмотрите Амплификатор Real-time DT-Lite как отправную точку. На карточке уже есть блоки S1, S2 и L1 и выбор 4 или 5 каналов.
Если нужна другая конфигурация блока или другое число каналов, подбор под задачу лаборатории ведёт Александра, технический специалист по подбору лабораторного оборудования.
- Тел.: 8 (499) 490-02-72
- Email: blog@assa-group.ru
Итог
Выбор компактного амплификатора в режиме реального времени упирается в формат блока под один прогон, в проверку мультиплекса на количественность и в NTC в каждом эксперименте. Амплификатор Real-time DT-Lite задаёт отправную точку по карточке: блоки S1, S2 и L1, 4 или 5 каналов, корпус 21 x 48 x 31 см, масса 17 кг и ПО DT-Master.
Источники:
- Bustin S.A., Beaulieu J.-F., Huggett J. и соавторы. MIQE précis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Molecular Biology. 2010. https://doi.org/10.1186/1471-2199-11-74
