Высокоскоростное центрифугирование клеток с охлаждением: три фракции из одной пробы без ультрацентрифуги
Чистота фракций ≥85,6% при спинах до 12 000 ×g — что показал протокол
В протоколе Dimauro и соавторов (BMC Research Notes, 2012) центрифугирование клетки мышечной пробы строится на рефрижераторных спинах и western blot маркерами компартментов. Для AT tissue доли маркеров по Table 2 ещё выше минимума по протоколу (n=5).
Практический вопрос: хватает ли высокоскоростного рефрижераторного режима с контролем температуры для субклеточного фракционирования клеточной пробы на уровне «хорошей чистоты» по маркерам, или всё равно нужна ультрацентрифуга? Ниже — условия S1, цифры Table 2 и границы переноса, без обзора всех схем фракционирования.
Центрифугирование клетки при высоких RCF: зачем охлаждение и контроль температуры
Полный разбор дифференциального центрифугирования по нарастающим ступеням RCF здесь не цель. На высокоскоростных шагах метода центрифугирования клетки авторы жёстко держат холод: от промывки cold PBS до явной фиксации 4 °C на ядерном лизате.
Ткань и клетки промывают cold PBS; клетки осаждают при 200 g 7 мин; ткань измельчают on ice в заранее охлаждённой чашке. Гомогенат держат на льду 30 мин, затем низкоскоростной спин 800 g 15 мин — разделение P0 и S0. Ядерная ветка уже требует контролируемого холода: лизат в NET крутят при 9 000 g 30 мин при 4 °C. Охлаждение здесь не опция, а условие: на высокоскоростном ядерном шаге авторы фиксируют температуру камеры.
Один и тот же RCF на роторах разного радиуса даёт разные об/мин. В клеточных протоколах важны и целевой RCF, и способность удерживать температуру на длинном спине, а не только «максимальные обороты на шильдике». Для методов изучения клетки центрифугирования воспроизводимость фракции часто ломается не на пересчёте RCF, а на прогреве пробы.
Запрос «центрифугирование органоидов клетки» часто ведёт к тому же классу оборудования — высокие RCF плюс холод. В S1 органоиды не изучали: выводы статьи относятся к мышечной ткани AT и клеткам линии C2C12 (миобласты и миотрубочки).
Нужен рефрижераторный высокоскоростной режим под клеточный протокол? Посмотрите высокоскоростную центрифугу KeCheng 4-30R — без переноса цифр чистоты из S1 на модель.
Условия эксперимента S1: от гомогената до спинов 11 000 и 12 000 ×g
Протокол даёт субклеточное фракционирование скелетной мышцы мыши (AT), миобластов и миотрубочек: относительно чистые ядерная, цитозольная и митохондриальная фракции из одной исходной пробы. Конкретная цепочка g, времени и температуры — один из рабочих методов изучения клетки центрифугирования, не обзор всех схем.
После гомогенизации на льду гомогенат 30 мин держат on ice, вортексируют на максимуме 15 с и центрифугируют при 800 g 15 мин: пеллет P0 (ядра/дебрис) и супернатант S0 для митохондрий и цитозоля. Первый спин ещё низкоскоростной: он отделяет грубый ядерный материал от митохондриально-цитозольной ветки, но сам по себе чистоту компартментов не доказывает.
Ядерную ветку промывают при 1 000 g 15 мин; лизат в NET — 9 000 g 30 мин при 4 °C; супернатант S6 становится финальной nuclear fraction. Холод уже не «на льду рядом», а заданный режим камеры на полчаса при 9 000 ×g.
Цитозоль и митохондрии идут из S0. После промежуточного спина 800 g 10 мин супернатант S2 крутят при 11 000 g 10 мин. Супернатант S3 осаждают холодным ацетоном при −20 °C не менее часа, затем 12 000 g 5 мин — пеллет P7 помечают как cytosolic fraction и ресуспендируют в 100–300 мкл STM. Митохондриальный пеллет P3 дополнительно моют при 11 000 g 10 мин.
Верхние 11–12 тысяч ×g и рефрижерация определяют класс оборудования для такого клеточного фракционирования — высокоскоростные RCF, не ультрацентрифужные.
Фракции и чистота: western blot и данные Table 2
Чистоту фракций центрифугирования клеток в этой работе проверяли western blot. Маркеры компартментов: histone H3 (ядра, ≈17 kDa), GAPDH (цитозоль, ≈37 kDa), CoxIV (митохондрии, ≈17 kDa). На блотах — плотные одиночные полосы в целевых фракциях при малой кросс-контаминации. Для миотрубочек отмечают чуть большую вариабельность и слабые неспецифические полосы в цитозоле, но общая картина маркеров сохраняется.
Количественно «purity» считают как долю оптической плотности (OD) маркера в целевой фракции относительно суммы OD по всем фракциям той же пробы. Это не абсолютная биохимическая чистота органелл, а распределение маркера между компартментами — удобная метрика для сравнения схем фракционирования.
| Компартмент | Маркер | Чистота, AT tissue (mean±SEM, n=5) | Минимум по протоколу |
|---|---|---|---|
| Ядра | H3 | 88,0±0,9% | — |
| Цитозоль | GAPDH | 87,8±0,3% | — |
| Митохондрии | CoxIV | 91,2±0,1% | ≈85,6% (CoxIV, миобласты) |
Границы переноса выводов
Объект — скелетная мышца мыши, миобласты и миотрубочки. Адаптацию к non-muscle samples авторы допускают только как starting point с правкой буферов и гомогенизации. Цитозольная фракция может нести microsomal content. Формулировка «without ultracentrifuge» относится к их протоколу до 12 000 g, а не к любому фракционированию. Валидация — western blot маркерами, не количественная протеомика. Другой контекст высокоскоростных спинов — например, высокоскоростная центрифуга для протеомики и StageTip — здесь не разбираем.
Рефрижераторное высокоскоростное центрифугирование в лаборатории: что учесть при выборе режима
Если клеточный протокол держит RCF до порядка 12 000 ×g и требует 4 °C (или шире — стабильный холод на длинных спинах вроде 9 000 g 30 мин), нужен класс «центрифуга высокоскоростная с охлаждением», а не ультрацентрифуга «на всякий случай».
Для таких задач в каталоге АССА есть высокоскоростная центрифуга KeCheng 4-30R: до 30 000 об/мин и 62 400 ×g, температура −20…+40 °C с погрешностью ±1 °C, максимальная вместимость 12×5 мл, автоматический расчёт RCF и об/мин с переключением режимов, сохранение до 99 программ. Рефрижераторная высокоскоростная центрифуга под клеточную пробоподготовку — без переноса цифр чистоты из S1 на конкретную модель.
Нужна рефрижераторная высокоскоростная центрифуга для клеточных протоколов?
Посмотрите высокоскоростную центрифугу KeCheng 4-30R.
Если в лаборатории нужен метод центрифугирования клетки с контролем температуры и RCF до десятков тысяч ×g — напишите: Александра, технический специалист по подбору лабораторного оборудования, поможет подобрать конфигурацию под ваш протокол. Результаты чистоты фракций из исследования относятся к протоколу авторов S1, не к цифрам на приборе АССА.
Тел.: 8 (499) 490-02-72
Email: blog@assa-group.ru
- S1: A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue — https://doi.org/10.1186/1756-0500-5-513
