Условия культивирования микроорганизмов: температура, орбита и кислород в колбе
Пик kLa = 650 h−1 (OTRmax = 135 mmol/L/h) при заполнении 10 mL в 250 mL гидрофильной стеклянной колбе, орбите 25 mm и 750 rpm: это примерно на 50% выше уровня типичных коммерческих орбитальных шейкеров. Цифра относится к конкретной геометрии, а не к «средней» паспортной величине. Условия культивирования микроорганизмов в колбах часто упираются не в температуру как таковую, а в то, успевает ли орбитальное перемешивание снабжать культуру кислородом. На практике нужно согласовать температуру, частоту и диаметр орбиты с кислородным переносом, чтобы режим не ломался уже на скрининге.
Кислородный потолок уже на этапе скрининга
Колбы доминируют на скрининге и ранней разработке процесса, но максимум кислородного переноса в них обычно ниже, чем в перемешиваемых реакторах. Если кислород недодают здесь, дальше «оптимизируют» уже субоптимальный режим: отбор клонов, среда и нагрузка по питанию выглядят иначе, чем при достаточном O2.
Для аэробных культур риск прямой: падает метаболическая активность, появляются нежелательные анаэробные побочные продукты, страдают количество и качество продукта. На практике температуру и fill фиксируют, а частоту орбиты берут «по привычке» или по пределу старого шейкера, и получают разный кислородный потолок при формально одинаковых условиях культивирования микроорганизмов.
Почему частота и диаметр орбиты задают аэрацию
Кислородный перенос в орбитально встряхиваемой колбе задают объём жидкости, частота встряхивания, диаметр орбиты и геометрия сосуда. Рычагов несколько: баффлы, меньший fill, больший диаметр колбы или орбиты, выше частота. У каждого есть цена.
Баффлы усиливают турбулентность, но повышают риск out-of-phase режима, пены и худшей воспроизводимости. Сильное уменьшение объёма или увеличение диаметра сосуда наращивает удельную площадь массообмена, но усиливает испарение. Для стандартных колб без смены геометрии авторы high-speed серии прямо пишут: увеличение частоты орбитального встряхивания остаётся единственным валидным и практически доступным способом повысить кислородный перенос.
Ограничение часто сидит в приборе. У обычных коммерческих орбитальных шейкеров предел частоты обычно около 400 rpm при орбите 25 mm. Выше нужны иная балансировка и контроль вибраций. High-speed режим для усиления кислородного снабжения выгоднее при 25 mm, чем при 50 mm: меньше нагрузка повышенной центробежной силы на систему встряхивания.
Режимы культивирования микроорганизмов в колбе нельзя сводить к «поставим 37 °C и средние обороты». Частота и диаметр орбиты вместе с fill задают, будет ли культура дышать свободно или упрётся в OTR.
Условия эксперимента: две серии измерений kLa
Ниже две независимые экспериментальные линии. Первая измеряет, насколько можно поднять kLa / OTRmax за счёт высокой частоты на прототипе self-balancing шейкера. Вторая показывает согласованный режим глубинного культивирования микроорганизмов в fed-batch HCDC E. coli и что происходит, когда рост обгоняет кислородный потолок.
K. lactis, 30 °C, 250 mL, орбита 25/50 mm (PMC11995246)
Культивировали Kluyveromyces lactis при 30 °C в 250 mL стеклянных колбах с гидрофильной поверхностью. Заполнение варьировали от 10 до 60 mL. Орбита 25 или 50 mm; на прототипе с self-balancing механизмом достигали до 750 rpm при 25 mm. Из OTRmax получали соответствующие kLa. Максимум зафиксирован при 10 mL, 25 mm и 750 rpm.
E. coli HCDC, 32 °C, 200 rpm, pitch 5 cm, baffled 500 mL (PMC8718739)
Вторая серия: глубинное культивирование микроорганизмов в режиме high cell density. Рекомбинантную E. coli вели в baffled PreSens колбах 500 mL. Культивации шли при pitch 5 cm, 200 rpm и температуре камеры 32 °C. Заполнение 100 mL среды (соотношение fill 1:5).
Связь объёма заполнения с номиналом колбы удобно держать одной строкой:
V_жидкости = V_колбы / n
При fill 1:5 и V_колбы = 500 mL получается V_жидкости = 500 / 5 = 100 mL, как в HCDC-серии. 200 rpm авторы выбрали как максимальную скорость с пренебрежимо малым пенообразованием для своей баффленной геометрии.
Что показали измерения OTR и растворённого кислорода
В high-speed серии на K. lactis максимальный kLa составил 650 h−1 (OTRmax = 135 mmol/L/h) при 10 mL заполнения, орбите 25 mm и 750 rpm в 250 mL гидрофильной стеклянной колбе. Это примерно на 50% выше уровня текущих коммерческих орбитальных шейкеров. Пик снят на прототипе, а не на типовом приборе с лимитом около 400 rpm.
| Система / колба | T, °C | rpm / орбита | kLa, h−1 | Практический вывод |
|---|---|---|---|---|
| K. lactis, 250 mL стекло, 10 mL, hydrophilic | 30 | 750 rpm / 25 mm | 650 | пик на прототипе; ~+50% к коммерческим шейкерам |
| E. coli HCDC, baffled 500 mL, fill 1:5 | 32 | 200 rpm / 5 cm | 133 | после 6 ч рост лимитирован O2; feed подстраивать под kLa |
В HCDC-серии kLa = 133 h−1 для 500 mL PreSens baffled колбы при 200 rpm, pitch 5 cm и fill 1:5. По профилю DO рост после 6 ч был лимитирован кислородом. При смене rpm или геометрии колбы подачу субстрата нужно подстраивать под измеренный kLa, иначе feed обгоняет аэрацию, и глубинное культивирование упирается в O2 при формально верной температуре.
Обе серии показывают одно: частота и диаметр орбиты вместе с объёмом задают кислородный потолок; температуру, обороты и подачу согласуют с ним, а не копируют «чужие» rpm без kLa или хотя бы контроля DO.
Что контролировать в лабораторном протоколе
Практический чеклист для условий культивирования микроорганизмов в колбах короткий и жёсткий.
- Зафиксировать геометрию: номинал колбы, баффлы или их отсутствие, материал (стекло/пластик), объём заполнения через соотношение fill.
- Записать температуру камеры и держать её стабильной на всём цикле, и на batch, и на fed-batch.
- Задать частоту и диаметр орбиты как пару параметров, а не «обороты вообще».
- Для кислородоёмких культур проверить, не упирается ли рост в O2 (DO-профиль, оценка kLa, поведение после выхода на высокую биомассу).
- Если меняете rpm, орбиту или fill, пересмотрите скорость подачи субстрата.
Орбитальный шейкер инкубатор здесь инструмент стабилизации режима, а не источник «магического» kLa. Для протоколов с одновременным контролем температуры (в том числе ниже комнатной) и орбиты в каталоге АССА есть напольный шейкер-инкубатор Zhichu ZC-186: диапазон 4-60 °C (окруж. 23-25 °C), орбита Ø 26 мм, скорость 30-320 об/мин, погрешность скорости ±1 об/мин, температуры ±0,1 °C, однородность ±1 °C (при 37 °C). Паспортных kLa/OTR у модели нет, их нельзя приписывать: потолок зависит от колбы, fill, среды и rpm. ZC-186 стабилизирует температурно-орбитальный контур, включая охлаждение; оценку аэрации оставляет протоколу лаборатории.
Ограничения и подбор шейкера-инкубатора
Три границы, которые нельзя размывать. kLa = 650 h−1 получен на прототипе high-speed шейкера при 750 rpm и гидрофильном стекле; это не типовой коммерческий предел около 400 rpm при 25 mm. Режим HCDC 32 °C / 200 rpm / pitch 5 cm относится к baffled 500 mL E. coli с fill 1:5; на небаффленные колбы и другие объёмы его не переносят без своего измерения. Для ZC-186 нельзя утверждать OTR или kLa без отдельного источника: у карточки есть температура, орбита и обороты, но не коэффициент массообмена.
Если подбираете шейкер инкубатор с охлаждением под протокол, где важны диапазон 4-60 °C и стабильная орбита около 26 mm, начните с карточки напольного шейкера-инкубатора Zhichu ZC-186.
Нужно согласовать температуру и орбитальное перемешивание под ваш протокол культивирования?
Если нужно согласовать температурный диапазон и орбитальное перемешивание под ваш протокол культивирования, напишите или позвоните: Александра, технический специалист по подбору лабораторного оборудования, поможет подобрать шейкер-инкубатор под задачу.
Александра, технический специалист по подбору лабораторного оборудования
Тел.: 8 (499) 490-02-72
Email: blog@assa-group.ru
Источники
- Effect of High-Speed Shaking on Oxygen Transfer in Shake Flasks. Biotechnology Journal. 2025. DOI: 10.1002/biot.70013 (PMC11995246)
- High cell density cultivation of E. coli in shake flasks for the production of recombinant proteins. Biotechnology Reports. 2021. DOI: 10.1016/j.btre.2021.e00694 (PMC8718739)
Теги: условия культивирования микроорганизмов, шейкер инкубатор с охлаждением, орбитальный шейкер инкубатор, режимы культивирования микроорганизмов, глубинное культивирование микроорганизмов