Процесс лиофилизации mRNA-LNP: режимы замораживания, первичной и вторичной сушки
Среди четырёх формулировок для long-term study 20% sucrose с 5 mM Tris (F1) показала наиболее устойчивое сохранение физико-химической целостности и трансфекции in vitro при 4 °C и 20 °C. Подобранный цикл сушки и криопротекторы переводят жидкую формулировку в сухую и позволяют удерживать активность без ультрахолодной цепи. Дальше - стадии процесса лиофилизации, режимы из публикации и что из этого переносится в лабораторную практику.
Что дала оптимизация цикла для mRNA-LNP
mRNA-LNP в жидком виде требуют холодовой цепи: термостабильность остаётся узким местом для распределения вакцин. Лиофилизация снимает воду и переводит продукт в твёрдую фазу, но сам freeze-drying добавляет стресс. Замораживание, обезвоживание и реконституция могут увеличить размер частиц и снизить инкапсуляцию mRNA.
Авторы искали сочетание сахаров, буферов и режима сушки, при котором после freeze-drying сохраняются размер (~200 nm), низкий PDI и encapsulation efficiency (EE) выше 90%, а функциональная активность подтверждается трансфекцией in vitro. На этапе long-term study сравнили четыре состава (F1-F4); лидером по совокупности физико-химических и функциональных показателей при хранении стала F1.
При 4 °C формулировки F1, F3 и F4 сохраняли сильный флюоресцентный сигнал трансфекции до четырёх месяцев. При 20 °C деградация нарастала: к шести месяцам росли размер и PDI, а EE снижалась до 40-60% (Figure 7). Лиофилизация расширяет окно хранения, но выбор excipients и температуры по-прежнему определяет срок годности.
Стадии процесса лиофилизации и контроль температуры продукта
В работе mRNA-LNP проходят три шага. Формулировку смешивают с криопротекторами и буферами и замораживают при очень низкой температуре. Первичная сушка идёт под вакуумом: лёд сублимирует, вода уходит из замороженной матрицы. На вторичной сушке удаляют остаточную влагу при более высокой температуре (в обзорной части статьи указан диапазон до 20-40 °C).
Замораживание и первичная сушка
На стадии первичной сушки сублимация и лиофилизация связаны напрямую: вакуум создаёт условия, при которых лёд переходит в пар, минуя жидкую фазу. Скорость и равномерность зависят от теплопередачи к продукту и от сопротивления сухого слоя пароотводу.
Вторичная сушка и риск коллапса
Для фармацевтической лиофилизации в целом важен контроль температуры продукта на primary drying. Эффективность теплопередачи и условия процесса - температура полок и давление в камере - определяют температуру продукта, которую нужно держать ниже порога collapse, иначе возможен коллапс структуры cake.
Конкретный порог collapse для mRNA-LNP в исходной работе не приведён; режим Table 3 подбирали с учётом glass transition temperature формулировок и предыдущих исследований по mRNA-LNP.
Условия эксперимента: цикл на Virtis Advantage Pro
Задача эксперимента - разработать процесс лиофилизации для долгосрочной стабильности mRNA-LNP с подбором криопротекторов. Цикл выполняли на установке Virtis Advantage Pro (это оборудование из публикации, не лабораторная модель из нашего каталога).
Параметры Table 3 задали температуру и давление на каждой стадии. Фактический цикл включал замораживание при −50 °C в течение 5 ч, первичную сушку при −30 °C 5 ч и вторичную сушку 1 ч с постепенным повышением температуры. Пробки устанавливали под вакуумом без инертной подушки.
| Стадия | Температура | Давление | Длительность (фактический цикл) | Источник |
|---|---|---|---|---|
| Замораживание | −50 °C | не указано | 5 ч | Table 3, Methods |
| Первичная сушка | −30 °C | ~60 mTorr | 5 ч | Table 3, Methods |
| Вторичная сушка | 20 °C | 30 mTorr | 1 ч (плавное повышение T) | Table 3, Methods |
Режимы лиофилизации в таблице - результат оптимизации под конкретные LNP и excipients. Перенос тех же температур и давлений на другой продукт или другую установку без повторной валидации авторы не предполагают.
Формулировки, остаточная влажность и активность после сушки
Криопротекторы и физико-химические показатели
Предварительный скрининг показал: 20% sucrose и trehalose с буферами Tris или histidine оптимальны для сохранения свойств при freeze-drying - EE выше 90%, размер частиц около 200 nm, низкий PDI (в abstract указано PDI < 0.2). Mannitol, gelatin и PBS давали худшие результаты: больший размер, нестабильные формулировки; для составов на PBS в скрининге отмечали PDI > 0,2, тогда как sucrose/trehalose с Tris или histidine оставались однороднее.
Сахароза и trehalose, по выводам авторов, повышают температуру денатурации липидов и glass transition, стабилизируя LNP при низком содержании воды. Mannitol увеличивал размер частиц и снижал EE из-за кристаллизации; gelatin давал крупные неоднородные частицы с очень низкой инкапсуляцией.
Функциональная активность после хранения
Метод оценивали не только DLS и Ribogreen, но и трансфекцией in vitro: флюоресценция репортёра отражает сохранность mRNA. F1, F3 и F4 оставались активными до четырёх месяцев при 4 °C; F2 к этому сроку уже слабее.
Чтобы сопоставить давление из Table 3 (mTorr) с диапазонами, в которых в смежной литературе измеряют теплопередачу, удобен перевод в паскали:
P [Pa] = p [mTorr] × 0,133
Для режимов статьи: первичная сушка ~60 mTorr (около 8 Pa), вторичная 30 mTorr (около 4 Pa); для замораживания давление в Table 3 не указано. В исследовании primary drying для флаконов с mannitol/sucrose коэффициент теплопередачи Kv измеряли при давлении камеры 5-30 Pa и температуре полок от −10 до +30 °C. При давлении выше 10 Pa Kv для флаконов во вложенной стойке (rack) оказывался ниже, чем при прямом контакте с полкой; ниже 10 Pa конфигурации были сопоставимы по эффективности теплопередачи. Это не численная оценка для mRNA-LNP, а контекст: способ загрузки флаконов и давление камеры влияют на реальную температуру продукта при той же температуре полок.
Границы переноса режима и конфигурации загрузки
Цикл −50 / −30 / 20 °C с давлениями Table 3 валидирован для конкретных mRNA-LNP на Virtis Advantage Pro. Другой состав, другой объём партии или другая геометрия загрузки требуют отдельной проработки.
Данные по rack vs shelf относятся к модельным растворам mannitol/sucrose во флаконах 2R, не к LNP из S21. Хранение при комнатной температуре даже для лучшей F1 всё равно сопровождалось прогрессирующей дестабилизацией к шести месяцам. Для прикладной лаборатории это значит: лиофилизация расширяет окно хранения, но не отменяет мониторинг EE, размера и функционального теста под вашу формулировку.
Вывод и настольная лиофильная сушилка для лаборатории
В рассмотренной работе процесс лиофилизации mRNA-LNP задаётся последовательностью температуры и давления на трёх стадиях плюс выбором криопротектора и буфера. Температуру продукта на первичной сушке держат ниже collapse; F1 (20% sucrose + 5 mM Tris) дала лучший баланс стабильности при 4 °C и 20 °C.
Для пилотных работ с биологическими объектами в лаборатории часто достаточно настольной сушилки с рабочей температурой до −50 °C. Лиофильная сушилка FreeZone 1 (Labconco) подходит для обезвоживания тканей, белков, нуклеиновых кислот и вакцин при низкой температуре в вакууме: производительность 1 л/сут, ёмкость конденсатора 1 л, рекомендуемая производительность вакуумного насоса 117 л/мин, ЖК-панель с автозапуском, сенсор влажности коллектора и интерфейс RS-232. В базовую комплектацию не входят вакуумный насос, камера, коллектор и колбы - их подбирают под задачу. Режимы цикла из Table 3 к этой модели не привязаны: на карточке не задан диапазон вакуума в Pa или mTorr.
Подробнее о лиофилизации биоматериалов с криопротекторами - в смежной статье блога.
Какой режим первичной сушки и комплектацию насоса выбрать под вашу формулировку? Лиофильная сушилка FreeZone 1 - настольный вариант для лабораторного freeze-drying; детали комплектации лучше сверить до заказа. Александра, технический специалист по подбору лабораторного оборудования, поможет с подбором: 8 (499) 490-02-72, blog@assa-group.ru.
Источники
- Investigation on a Freeze-Drying Process for Long-Term Stability of mRNA-LNPs. PMC: PMC13030275
- The Freeze-Drying of Pharmaceuticals in Vials Nested in a Rack System-Part II: Primary Drying Behaviour. PMC: PMC10674193
Теги: процесс лиофилизации, лиофилизация, лиофильная сушка, температура лиофильной сушки, freeze-drying